Nature系列综述mRNA的Poly

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望夜

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兮

真核生物中，几乎每条mRNA的尾部都会带有多聚腺苷酸，即poly(A)。早期基于实验证据的假说认为，poly(A)尾与胞浆中的多聚腺苷结合蛋白（PABPC）促进翻译并阻止mRNA降解（decay），但具体机制并不清楚。最近对Poly(A)尾的作用认识更加丰富：poly(A)结合蛋白可以促进poly(A)的去除（即发生脱腺苷化，deadenylation），而当mRNA稳定且高频翻译时，poly(A)在稳态下的长度远低于预期。此外，翻译延伸的速率会影响脱腺苷化。因此，poly(A)尾、PABPC、翻译过程和mRNA降解间的相互作用在基因调控中起重要作用。

为全面介绍胞浆中poly(A)尾的最新研究进展，年9月30日，英国MRC的LoriA.Passmore教授和美国约翰霍普金斯大学的JeffColler教授合作在NatureReviewsMolecularCellBiology上发表题为RolesofmRNApoly(A)tailsinregulationofeukaryoticgeneexpression的综述文章，重点讨论：poly(A)尾在翻译和控制mRNA稳定性中的作用、核酸外切酶（脱腺苷酶）CCR4-NOT和PAN2-PAN3如何去除poly(A)尾、如何测定脱腺苷化率、脱腺苷化如何与其他细胞过程协调及PABPC功能等话题，并展望该领域未来的研究方向。现编译全文，以飨读者。

在mRNA研究早期，科学家就发现其3’端尾部有多聚腺苷酸存在。事实上，除个别哺乳动物组蛋白的转录本（transcripts）外，真核生物几乎所有mRNA都带有poly(A)尾。poly(A)尾是在转录的同时添加到mRNA上的，是成熟mRNA由细胞核外运至胞浆必需的（图1）。哺乳动物的poly(A)尾平均长度约为nt，其在酵母中平均约70nt。

图1mRNApoly(A)尾在胞浆中调控基因表达的功能概览

poly(A)尾对翻译状态和mRNA的稳定性都有贡献，因而是胞浆中基因表达的关键调节因子。特别是，poly(A)尾可与mRNA5’端的7-甲基鸟嘌呤（m7G）在功能上起协同作用，促进翻译的进行。当一个转录本失去poly(A)尾时，其翻译将处于较低水平，同时也意味着其5’端的帽子结构即将被去除，发生脱帽（decapping）。因而，poly(A)尾变短（即脱腺苷化）最终会导致翻译过程被抑制，mRNA随即被降解。脱腺苷化的速率是以转录本特异的方式响应胞浆内信号而被调节的。在某些特殊情况下，poly(A)尾还可能在胞浆中被延长以便再激活某些翻译受抑制的转录本或用来维持其稳定性。故，poly(A)尾的动态对基因表达的调控至关重要，几乎在真核生物的各个生命过程中均起重要作用，这包括在发育早期、炎性反应和突触可塑性中。对应于基因调控中的保守、关键作用，许多关键转录本要么带有poly(A)尾，要么使用一个等效替代物行使poly(A)尾功能，例如在后生动物（metazoans）中，依赖复制过程的组蛋白mRNA的poly(A)尾就被一种独特的3’核糖核蛋白（RNP）复合体所替代。

mRNA的转录后调节（含poly(A)尾长度的调节）是基因表达最精确的调控方式，决定蛋白质组的组成。转录本的调节各不相同，导致翻译效率和mRNA稳定性存在巨大差异性，不同转录本翻译效率之间的差别达倍以上，而mRNA半衰期的差异也在相同数量级上。最近测序技术、生化重建、结构生物学的进步，使得研究者对poly(A)尾生物学的认识提高到一个崭新的分子层面。目前已确认，poly(A)尾长度并非如之前设想的那样恒定不变，poly(A)尾中也可以含有非A的核苷酸组分，poly(A)尾长度、翻译效率和mRNA稳定性之间并不是简单的线性关系。

在这篇综述中，作者讨论了poly(A)尾在胞浆中的作用，尤其是对翻译和mRNA稳定性的调节，以及脱腺苷复合物CCR-NOT和PAN2-PAN3去除poly(A)尾的机制。还讨论了脱腺苷化的速率是如何调控的，脱腺苷化是如何与其他细胞过程相协调，及胞浆中主要多聚腺苷结合蛋白（PABPC，人中称PABPC，酵母中称Pab1）的作用。文章以探讨历史上关键发现起笔，接着讨论近期对poly(A)尾认识的提高，最后对胞质中mRNA翻译和降解领域未来研究重点进行了展望。

一、poly(A)尾支持mRNA翻译

年代的开创性研究就已发现poly(A)尾对高效翻译至关重要。例如，在受精后，海胆卵的细胞质中转录本的多聚腺苷化在短时间内激增，同时母本mRNA处于翻译静息状态，这些mRNA的poly(A)尾通常都非常短；但在卵细胞成熟时这些poly(A)尾则会延长，它们所对应的蛋白也同时开始表达。最具戏剧性的是，胞浆中的多聚腺苷化对原癌基因c-mos的激活是必要且充分的，将驱动蛙卵的减数分裂成熟，也表明这些poly(A)尾是新出现的，用以开启翻译过程。同时期的研究显示，在突触连接处某些转录本处于翻译静息状态，它们都含有类似卵母细胞中母本mRNA样的短poly(A)尾。突触刺激会同时导致出现多聚腺苷化和翻译过程的激活。上述证据说明，mRNA的翻译广泛地受到poly(A)尾长度调节的影响。

卵母细胞中母本mRNA和神经细胞中mRNA的保存和激活几乎在所有分子细节上都是类似的，包括参与调控该过程的蛋白因子。上述两种特殊例子中，poly(A)尾长度与翻译效率正相关，即poly(A)尾越长，翻译效率越高。因此poly(A)尾的代谢是动态的，是基因调控中的一个关键节点，在多个生物过程中均起到杠杆的作用。胞浆中多聚腺苷化的发现开启了一个全新的研究领域，对该段历史细节此前曾有综述探讨过。

在翻译起始阶段，蛋白因子聚集到mRNA的5’端用以招募40S核糖体小亚基并促使其沿着5’端的非翻译区（UTR）扫描直到发现起始密码子。随着起始密码子处翻译原件的组装，起始复合体加入到核糖体60S大亚基中从而形成完整的80S核糖体，此时起始tRNA进入核糖体中的P位点。目前已确认3’端poly(A)尾可以影响5’端的翻译起始。然而，尽管三十年来不断有研究强调poly(A)尾促进翻译，其准确机制仍未获得阐述。部分原因在于研究poly(A)尾的实验方法相对滞后，体外翻译体系往往无法重现poly(A)的作用。另外，胞内的动态平衡机制会抵消基因表达层面人为引入的干预，使得在体（invivo）研究其机制变得更加困难：当人为打断一条通路时，机体可能会用另一条途径代偿。还有，胚胎细胞和胚后细胞中poly(A)尾的作用往往不同，下文将讨论这一点。最为重要的是，目前已知调控poly(A)尾的主要因子PABPC蛋白非常难以研究。

（1）PABPC的作用

早在发现mRNA末端带有poly(A)尾时就已确认胞浆中的poly(A)尾被PABPC结合着。酵母中只有一种PABPC蛋白（Pab1），哺乳动物中则存在多种变构体（isoform），其中PABPC1是研究最充分的一种，很可能也是多种细胞类型中含量最丰富的一种。其它变构体，如PABPC4，可能是转录本特异的，此外胚胎中存在ePABP，睾丸中存在tPABP。PABPC在真核细胞中高度保守，其N端带有4个RNA识别基序（RRM）结构域，可以纳摩尔级别的亲和力结合poly(A)尾。RRM1和RRM2对poly(A)尾的亲和力和特异性高于RRM3和RRM4。晶体结构显示，在结合poly(A)尾时RRM1位于RRM2的3’端。RRM结构域之后是一段富含脯氨酸的连接区，C端为MLLE结构域。MLLE结构域识别一段多肽基序（PAM2），该基序在参与调节poly(A)尾动态的多种PABPC伙伴蛋白中存在。核内的poly(A)尾结合蛋白（人体中为PABPN1，也称PABPC2；在酵母中为Nab2）含有不同的结构域组织形式，也影响多聚腺苷化过程，但本文不讨论PABPN的功能，感兴趣的读者可以参见。

PABPC需要（经RRM1和RRM2）结合12个腺苷酸以达到高亲和力，但在生理条件下覆盖着30个核苷酸。较长的poly(A)尾可结合更多的PABPC，如一个90nt长度的poly(A)尾可结合3分子PABPC。临近的PABPC之间的互作可以促进彼此结合poly(A)尾上的RNA，进而促进PABPC的多聚化。但近期研究发现，胞内PABPC的聚集是有限的，处于稳定状态的poly(A)尾与PABPC数量并不总是对应的，这一点下文将详述。

PABPC功能的认识主要来源于早期对酵母的研究。已在酿酒酵母中发现两类PAB1突变体的旁路抑制子：其一是60S大亚基编码基因及60S生成因子中的突变，其二是mRNA降解相关基因中的突变，这些基因包括脱帽调节子（PAT1、LSM1及DCP1）和5’-3’核酸外切酶1（XRN1）、3’-5’核酸外切酶RRP6。上述发现与PABPC在翻译中的作用相对应，但它们也说明PABPC（及poly(A)尾）在调控mRNA稳定性中发挥关键作用。PABPC对poly(A)尾行使调节转录本翻译和稳定性的功能是必要且充分的，这一点下文亦将详述。

（2）闭环模型

mRNA5’端的m7G帽子结构在调节翻译中发挥重要作用。帽子结构直接结合翻译因子促进翻译的起始，而5’帽子和3’poly(A)尾的协同进一步促进该过程，这在植物、动物、酵母中均已观察到。相较于单一修饰，当同一mRNA上同时存在帽子和尾时，翻译效率的提升更为剧烈。

那么mRNA3’端如何促进5’端的翻译起始呢？真核翻译起始因子eIF4E识别5’端帽子，同时也可结合另一个起始因子eIF4G，后者可以结合PABPC。因而，mRNA可以形成一个“闭环”，允许5’帽子和3’poly(A)尾直接发生相互作用。eIF4G与PABPC的相互作用稳定了eIF4E-帽子的相互作用，类似地，PABPC与poly(A)尾的相互作用又稳定了其与eIF4G的相互作用。PABPC还可激活另一种翻译起始因子eIF4A，加强其ATP酶和解旋酶活性。合起来，帽子-eIF4E-eIF4G-PABPC-poly(A)尾复合体被认为可以（至少部分可以）激活翻译，通过招募40S核糖体小亚基来实现（图2）。

图2翻译起始的闭环模型

在此不妨比较一下mRNA在翻译中的闭环与DNA复制中的滚环。在DNA复制中，滚环分子可以双向进行复制过程从而极大提升产量，并使DNA聚合酶周而复始地循环往复。而在mRNA翻译中又是另一番场景：尽管DNA复制可以是不间断的，翻译却是间断性的，必须分为不同的阶段，任何一条多肽链的翻译都必须经历起始、延伸、终止的过程。但是，mRNA的闭环模型使得翻译终止发生在物理上临近起始的位置，从而潜在地允许核糖体再次回到同一转录本的起始密码子处。转录本的闭环翻译还可作为一种质控机制，即不允许翻译起始于已经部分降解的mRNA上。

直接的生化证据显示，PABPC和eIF4G可以介导mRNA的环化，但该“闭环”可能并不像最初设想的那样简单。举个例子，胞内RNA的单分子成像支持一个模型，即尽管mRNA并未处于完全伸展状态，其5’和3’端的距离也不够近，不足以通过eIF4E、eIF4G和PABPC实现物理接触。类似的体外与体内实验结果不吻合的例子，可能由于不同实验的设置上存在差异。不过，虽然闭环模型适用于某些mRNA，这种环化可能也是动态的，可能并未发生在全部转录本和/或所有生命过程中。此外，确有不少证据表明mRNA的5’和3’端存在相互作用，但是否真的形成闭环，以及帽-尾间关系的本质是什么？这些问题仍存有异议。对不符合该模型的一些关键证据下文将详加讨论，在此推荐近期的一篇综述对该问题也进行过深入探讨。

二、poly(A)尾与mRNA的稳定性

早期的实验证据显示，核酸外切酶降解poly(A)尾是时间依赖的。当向非洲爪蟾卵母细胞中注射带有poly(A)尾的mRNA时，32nt以上的poly(A)尾在翻译效率上就等同于nt长度的poly(A)尾。但当poly(A)尾长度不足16nt时，mRNA无法翻译，而且胞内很少观察到poly(A)尾长度在30nt以下的mRNA。上述证据综合起来说明poly(A)尾稳定了mRNA（允许其翻译），30nt通常是mRNA实现稳定性的下限，而这正好是PABPC对poly(A)尾长度的最低要求。但凡事都有例外，带有极短（小于20nt）poly(A)尾甚至不含poly(A)尾的mRNA也可稳定存在并能有效翻译，这包括组蛋白的mRNA、某些病毒的转录本、及某些含有特定序列使得poly(A)尾限制在20nt以内的mRNA。当然，不含poly(A)尾却能有效翻译的mRNA是极个别的例外。

那么poly(A)尾如何行使稳定功能呢？一种假说认为，PABPC保护mRNA3’端免受核酸外切酶的降解。证据是一系列的实验，如转录水平的脉冲追踪（pulsechase）及体外重建实验显示，poly(A)尾变短或发生脱腺苷化时mRNA开始有序的降解，彼时均需要PABPC首先从mRNA上释放下来。向体外降解系统中加入额外的poly(A)用以结合PABPC，reporterRNA上的poly(A)尾会暴露，进而导致其稳定性降低；相反地，如果向该系统中加入过量的PABPC则会抑制脱腺苷化。

经典的mRNA降解通用模型中，poly(A)尾首先缩短至10-12nt，5’帽子随即被去掉，转录本将被XRN1沿着5’-3’方向降解或被胞浆中的外切体（exosome）沿着3’-5’方向降解。脱腺苷化被认为是经典的mRNA降解模型中的限速步骤。不同转录本的脱腺苷化效率存在差别，是序列依赖的，这导致mRNA半衰期差异巨大。

前述mRNA“闭环”模型或许可以解释poly(A)尾是如何影响脱帽的。eIF4E-eIF4G-PABPC的相互作用将eIF4E稳定于帽子结构上，从而阻止脱帽酶与其接触。证据是，eIF4E和脱帽复合体可以竞争性结合帽子结构，至少在体外实验中是这样的。此外，人源PABPC1可以直接结合5’帽子。因此，PABPC应该是通过作为空间位阻隔绝脱帽酶与帽子结构的直接接触实现稳定mRNA的。与此相呼应，酵母中仅带有极短寡聚腺苷酸的mRNA无法有效结合PABPC，但可以结合七聚的Lsm1-7蛋白复合体，后者可以直接结合脱帽复合体，同样证明5’和3’端的联系。

综合上述证据，mRNA的5’端服务于poly(A)尾介导的mRNA稳定性和翻译效率控制体系。但一些证据并不支持这一模型，例如在酵母中删除PAB1基因导致处于稳定状态长度的poly(A)尾数目增加，且脱腺苷化的速率降低。如果Pab1只是用来阻止3’核酸外切酶接近poly(A)尾，那应当观察到相反的现象。类似地，在小鼠提取物体系中，PABPC1也是脱腺苷化所必需的。上述体内实验结果因PABPC的多效性变得复杂，需要综合poly(A)尾如何去除的实验证据来分析。下面就讨论这一问题。

三、poly(A)尾长度的调控

poly(A)尾变短或去除是通过特定的核酸外切酶实现的，它们特异性地靶向腺苷酸，属于脱腺苷酶（deadenylase）。真核生物胞浆中的脱腺苷化主要由两种蛋白复合体完成，分别为PAN2-PAN3和CCR4-NOT。

（1）脱腺苷酶

Pan2-Pan3最初是在酵母提取物中发现的，其Pan2亚基中含有一个DEDD/RNaseD型核酸外切酶。在该复合物中，2个拷贝的Pan3形成一个不对称的二聚体，为1分子Pan2提供支架。酵母中编码Pan2和Pan3的基因是非必需的，敲除任一基因会导致稳定状态的poly(A)尾变长但不会消除脱腺苷化，因为Pan2-Pan3在一定程度上与Ccr4-Not功能冗余。

PAN2-PAN3被招募至poly(A)处至少需要三组相互作用：PAN3N端锌指结构特异性结合腺苷酸、PAN3的PAM2基序结合PABPC、附加区域与PABPC-poly(A)复合体相互作用。因此，通过将PAN2-PAN3招募至poly(A)RNA，PABPC激活脱腺苷化。这已在体内和体外的完全纯化组分实验中观察到。此外，Pan2上的外切核酸酶活性是特异性针对poly(A)RNA的，因为它识别的是一种仅在poly(A)中发现的、固有的、单链螺旋构象的RNA（图3）。在microRNA介导的沉默复合体中，PAN2-PAN3可通过与GW蛋白互作被招募至特定转录本，但目前尚不知如何或是否会特异性被招募至其他转录本上。

图3poly(A)RNA的结构

poly(A)RNA为何独特？其独特性就在于可形成一种单链的A型构象螺旋，这已被多个晶体结构证实，且近期研究发现在这种螺旋中碱基彼此堆叠。上图中，紫色的poly(A)RNA结合于Pan2的外切核酸酶结构域（粉色）（PDB：6R9J），而Pan2通过接触RNA的磷酸核糖骨架识别其特异的A型螺旋构象。

第二种主要脱腺苷酶是CCR4-NOT，分子量0.5MDa，由7个核心亚基组成，包含两种外切核酸酶，其一是CCR4-相关因子1（Caf1，在哺乳动物中也称为CNOT7或CNOT8，在裂殖酵母中称为Pop2），是一种DEDD型外切酶；其二为Ccr4（在哺乳动物中也称为CNOT6或CNOT6L），是一种EEP型外切酶。酵母中缺失Caf1或Ccr4导致脱腺苷化变缓或不完全。Not1亚基作为支架供Ccr4-Not组装，在酵母中是唯一事关生存的亚基，这可能由于Not1的几项功能无法被替代。CNOT2亚基（酵母中称Not2）和CNOT3亚基（酵母中称Not3和Not5）与脱帽相关，CNOT9（在出芽和裂殖酵母中分别称为Caf40和Rcd1）是与RNA和几种RNA结合蛋白（RBPs）互作所必需的。CNOT4（在出芽酵母中称Not4）是一种E3泛素连接酶，可对核糖体的蛋白组分进行单泛素化修饰并促进其降解。CCR4-NOT由RBPs特异性招募至转录本。

研究还发现第三种脱腺苷酶，poly(A)特异的外切核酸酶（PARN），仅在脊椎动物中存在，可能有更加特化的功能，如参与RNA成熟，核内小RNA、PIWI互作RNA、microRNA的稳定性，本文不作特别讨论。

脱腺苷化的两阶段模型

胞内为何需要多种脱腺苷酶？它们分别靶向不同种类的mRNA吗？还是响应不同的刺激？一种假说认为主要脱腺苷酶复合体采用一种两阶段（顺序）模式行使功能，其中PAN2-PAN3去除远端的poly(A)尾，CCR4-NOT去除更靠近3’端的腺苷酸（图4）。

图4脱腺苷化的两阶段模型

敲除酵母的PAN2基因导致稳定状态的poly(A)尾延长至90nt，而野生型中这一长度大约为70nt，这与去除远端poly(A)尾能力受损是一致的。敲除CCR4导致poly(A)尾延长大约20-40nt，并导致脱腺苷化的终点由10nt延长至20nt，说明其主要功能在于去除靠近3’UTR的poly(A)序列。如果同时敲除PAN2和CCR4会加剧脱腺苷化的功能缺失，体外研究也获得类似的结论。哺乳动物细胞实验显示，PAN2对脱腺苷化过程中较慢的起始阶段至关重要，该过程主要去除较长（-nt）poly(A)尾的远端部分；而CCR4主要在快速的第二阶段起作用，用以去除最后nt的poly(A)尾。相较于PAN2-PAN3，CCR4-NOT复合体的活性更容易发挥，这也解释了其更快的脱腺苷化速度。因此，PAN2-PAN3和CCR4-NOT在部分功能上是冗余的，但它们各自在poly(A)尾去除的不同阶段发挥主要作用。PAN2-PAN3不太可能对mRNA的半衰期起决定作用，它更可能在某些特定的细胞环境中发挥重要作用。

近期冷冻电镜解析的酵母Pan2-Pan3复合体结构解释了其倾向于去除poly(A)尾远端部分的原因。在该结构中，90nt的poly(A)RNA被3分子Pab1结合。poly(A)-Pab1复合体以锯齿形构象在Pan2-Pan3表面蜿蜒穿行，相邻的Pab1分子间及其与脱腺苷酶间均存在相互作用。由于Pan2-Pan3识别Pab1寡聚体界面，它倾向于与长度足以结合多个Pab1分子的poly(A)RNA发生互作。因此，该模型提示，poly(A)尾较短时，与Pan2-Pan3的亲和力会下降。如果哺乳动物来源的PAN2-PAN3复合体结构获得解析，将明确其如何在更长的poly(A)尾上发挥类似功能。

无论PAN2-PAN3亦或CCR4-NOT均特异性作用于poly(A)序列上，它们去除poly(A)尾却不会作用于3’UTR区，mRNA降解仅在poly(A)尾变到很短（小于10nt）时发生。因此，在顺序模型中，相较于PAN2-PAN3，CCR4-NOT在诱发mRNA降解上发挥更重要的作用，这是因为前者仅启动脱腺苷化作用，而后者完成了该过程。与此相对应，在哺乳动物细胞中敲除CCR4-NOT组分会全局性延长mRNA半衰期，而敲除PAN2-PAN3对mRNA半衰期的影响不大。

CCR4和CAF1的不同作用

另一个关键问题是，在CCR4-NOT复合体中两种核酸酶分别起何种作用？在出芽酵母中敲除CCR4对脱腺苷化的影响大于敲除CAF1。但正如上文提到的，体内的稳态机制会代偿基因表达缺失带来的影响，使得对实验结果的分析更加复杂。

使用纯化的重组裂殖酵母蛋白，允许在活性位点引入点突变以分析每个核酸酶的作用。在该体外实验中，Ccr4和Caf1均可切割poly(A)尾。任一核酸酶上的点突变均未显著影响其对裸露的poly(A)RNA分子的脱腺苷酶活性。但Caf1无法脱除结合有Pab1的RNA分子上的腺苷酸，而Ccr4可结合Pab1并将其从poly(A)尾上解离下来。在人源的CCR4-NOT中也观察到类似的现象。综上，CCR4-NOT中的两种核酸酶发挥不同的功能：CAF1降解裸露的poly(A)RNA，可被PABPC阻断；而CCR4可释放PABPC，因此可以脱除被PABPC结合的poly(A)RNA中的腺苷酸。此外，CAF1发挥功能依赖于翻译过程，而CCR4并不依赖于翻译本身。再有，这项研究还说明PABPC不仅阻断RNA的3’末端，还可同时激活PAN2和CCR4，这也解释了敲除酵母中PAB1导致poly(A)尾脱除速率变缓的原因。上述结果还提示可能存在一种调控机制决定使用何种核酸酶。

（2）脱腺苷化速率由谁控制？

脱腺苷化速率及不同转录本半衰期之间的差异可达倍以上，这就引出一个问题，poly(A)尾是如何被不同的脱腺苷酶识别从而开启转录本特异的mRNA降解呢？答案毫无疑问在于转录本的其它部分，而非poly(A)本身。首先，特殊的识别序列（通常位于3’UTR）被RBP识别，进而招募相应的脱腺苷酶；其次，RNA序列影响翻译延伸速率，也是决定mRNA半衰期的主要因素。近期有人提出一个模型，认为对mRNA半衰期的贡献中mRNA序列占比将近60%：其中3’UTR贡献5.5%，密码子使用频率占比55%。

大部分已知的脱腺苷化调控功能都是针对CCR4-NOT复合体实现的，目前尚不确认PAN2-PAN3的活性是否受到调控，后者是否通过不同的RNA接头蛋白靶向特定的转录本，以及其是否作为“修剪”poly(A)尾长度的通用因子。考虑到PAN2-PAN3在进化上是保守的，作者认为它应该在mRNA降解中发挥一个主要但尚未明确的功能，可能只针对某类转录本或只在特定条件下响应。

靶向转录本的脱腺苷化

CCR4-NOT通过RBP招募至特定mRNA的模型已获得很好的阐释，其中RBP是作为接头蛋白连接了3’UTR上特定的序列与脱腺苷酶，例如tristetraprolinRBPs识别富含AU的元件，而Pumilio/FBFRBPs使用一个调节子系统识别Pumilio响应元件。microRNA诱导的沉默复合体也可以介导靶向的脱腺苷酶，因为其GW亚基可直接与PAN2-PAN3和CCR4-NOT复合体相互作用。近年来还报道多种RNA-脱腺苷酶接头蛋白，如nanos、roquin及YTHDF2。

介导靶向脱腺苷化的RNA接头蛋白在RNA结合结构域外往往还含有内部无序区（IDRs）。IDRs中的短基序可与CCR4-NOT互作，且往往是同一接头蛋白中的多段基序与同一脱腺苷复合体发生互作，提示互作界面是复杂且多段的。但IDRs中的互作区段不易鉴定，因为它们在序列上通常并不高度保守，不同物种中的结合机制也存在差别。

在细胞中人为将RNA接头蛋白与报告基因的转录本连接起来会提高脱腺苷化和RNA降解水平。类似地，在体外完全重建体系中，包括tristetraprolin和Pumilio/FBF在内的RNA接头蛋白可以实质性地加速靶标RNA分子的脱腺苷化。因而RNA接头蛋白可以将mRNA和脱腺苷复合体栓连（tethering）起来，借助这种物理上的拉近，脱腺苷化速率可通过转录本特异的方式获得提升，脱腺苷化活性更易实现。该过程是高度可调控的，因为调节机制既可协调RNA接头蛋白与mRNA间的亲和力，又可调节RNA接头蛋白与脱腺苷复合体间的亲和力，例如当胞内的tristetraprolin发生磷酸化时其结合CCR4-NOT的能力被削弱，这就稳定了炎性反应相关mRNA。此外还有其它调控机制，如协调或竞争RNA接头蛋白对RNA的结合能力。

翻译与脱腺苷化速率间的关系

越来越多的证据显示，翻译过程影响poly(A)尾的动态，例如，无论以顺式或者反式抑制翻译起始时都会提升长寿命转录本的脱腺苷化速率。而且，从酵母到人中，翻译的延伸速率都可调节脱腺苷化速率，是以密码子适配性（codonoptimality）的方式进行的。密码子适配性是指核糖体通读61种有义密码子的速率并不相同，功能性tRNA丰度的微妙差异及对侧翼密码子的识别都会影响解码速率，这种影响随转录本的延伸逐个累积，进而影响整体延伸速率。令人惊奇的是，延伸速率是会被mRNA脱腺苷复合体和脱帽复合体感知的：当mRNA上结合移动速度较慢的核糖体时，将以CAF1依赖的方式发生快速的脱腺苷化和脱帽；而当mRNA结合快速移动的核糖体时，可更高效地规避poly(A)尾降解和脱帽。需要指出的是，经典的密码子适配性，即tRNA丰度的差异，并非阻滞延伸过程并影响脱腺苷和脱帽的唯一因素，其它诸如tRNA氨酰化、tRNA和mRNA的修饰、氨基酸的识别和丰度、mRNA序列和结构、密码子上下文、核糖体出口处多肽的氨基酸组成及新生多肽链的折叠等因素均可减缓翻译的延伸速率，均可被脱腺苷酶和脱帽复合体感知。

这就出现一个场景，延伸速率下降时诱发核糖体出现一种特殊构象，而脱腺苷酶和脱帽复合体可感知该构象。已有多种CCR4-NOT与翻译机器互作的模式被报道，如在酵母中，Ccr4-Not复合体结合并泛素化新生多肽链，该过程由Not4催化；Not4还可泛素化核糖体蛋白eS7以响应胁迫。另外，最近发现当翻译过程中核糖体的A位和E位空缺时，Not5会结合其上，这往往对应着转录本上出现非最优密码子组合；而删除Not5上可结合核糖体E位点的结构域或在eS7的泛素化位点引入突变时，可以稳定含有非最优密码子组合的转录本，并可阻止脱帽激活蛋白Dhh1的结合。因此，Not5结合核糖体与Not4介导的eS7泛素化可能直接感知并/或发出延伸放缓的信号，使得mRNA转向脱腺苷化和脱帽。

上述证据表明，存在一个关键因素调节转录本特异的脱腺苷化，即脱腺苷酶对不同核糖体活性和状态的监控。延伸速度较慢的核糖体或许可以作为另一种RNA接头蛋白，桥接起mRNA和CCR4-NOT。因此，很可能胞内几乎所有脱腺苷化都是通过概念上类似的RNA接头蛋白介导完成的，它可能是一种RBP、核糖体或者其他未知的因子，而一旦缺少RNA接头蛋白，脱腺苷化将减慢至无法对mRNA降解起主要作用。

其他参与因子

一项针对酵母mRNA半衰期的大型研究及多项人体细胞的研究显示，RNA序列和结构也是mRNA稳定性的主要决定因子。例如，当3’UTR中出现poly(U)时，可以与poly(A)配对从而阻止Pab1的结合，某些3’UTR中存在的茎环结构也可延长mRNA半衰期。茎环结构可阻止脱腺苷酶招募至单链RNA或可改变PABPCRRM4结合于3’UTR。此外，由于可变剪切和多聚腺苷化导致的转录本最后3nt的微小差异可使其半衰期延长一倍甚至更多。与此相一致，体外实验中RNA序列可以直接影响脱腺苷速率。因此，将脱腺苷复合体直接招募至特定序列可能也会影响脱腺苷速率。

另有一些因子可以通过调节脱腺苷酶和PABPC的互作实现对脱腺苷化的控制。该类调节子通常具有PAM2基序用以直接接触PABPC上的MILLE结构域，如TOB蛋白可与CCR4-NOT互作，同样含有一个PAM2基序用于结合PABPC并促进脱腺苷化。TOB2与PABPC的互作受到磷酸化的调节。LARP1和LARP4直接结合poly(A)RNA并通过PAM2基序直接结合PABPC1。这类因子藉此保护mRNA免于脱腺苷化，可能是通过稳定PABPC的结合。此外，转录终止因子eRF3也通过PAM2基序与PABPC互作，因而将poly(A)尾与翻译联系起来。另有一些poly(A)调节蛋白也含有PAM2基序，如GW和PAIP1、PAIP2。所以，含有PAM2的蛋白可以调节poly(A)尾的动态。

最后，非A核糖核苷酸插入到poly(A)中可通过转录本特异的方式减缓脱腺苷化，可能源于G的插入导致poly(A)螺旋构象发生变化。测序证实，非A核苷酸有时也出现在胞内的poly(A)尾中，而G的出现与mRNA的稳定性是相关的。体外脱腺苷实验中G是最不易被去除的。PAN2-PAN3去除C和U的效率略低于A，CCR4-NOT对A的选择性高于PAN2-PAN3。有趣的是，病毒会促进非A核苷酸插入其转变本的poly(A)中，以此防止被宿主的脱腺苷化机制所降解。而poly(A)尾短于25nt的转录本中往往还带有一段寡聚的U尾，这与尿苷化是一种降解促进信号是一致的。

四、反思mRNA代谢

近期对poly(A)尾生物学的研究热潮再次兴起。测序、蛋白表达及冷冻电镜技术的发展带来对poly(A)尾长度和组成及脱腺苷化复合体的功能机制的新认识，极大地改变了poly(A)尾长度、翻译和RBP如何影响基因表达的观点。

（1）poly(A)尾长度的重要性

直到最近人们对poly(A)尾长度如何调节mRNA代谢的认识仍然十分有限，这受限于如何在转录组水平上对poly(A)尾进行精确分析。以TAILseq、mTAILseq、PALseq、FLAMseq、PATseq及纳米孔测序为代表的测序技术的进展使得探究poly(A)长度和序列成为可能。利用上述技术，发现poly(A)长度的范围更广，例如在人体中甚至可以超过nt，但很长的poly(A)尾毕竟是极罕见的。多项研究证实，处于翻译活跃状态的mRNA其poly(A)尾在稳定状态下相对较短，仅约30nt，而不怎么翻译的mRNA却含有相对更长的poly(A)尾。整体而言，典型的poly(A)尾长度在酵母中是30nt，在其他真核生物中为50-nt，这包括人、鼠、果蝇、线虫。这与阿米巴虫稳定转录本中的研究结果是一致的，其poly(A)为40-60nt。体内和体外研究发现poly(A)尾的长度以30nt为基数递增，这符合结合多个PABPC的要求。

上述发现有重要启示意义。首先，翻译活跃状态的转录本仅含有约30nt长度的poly(A)尾，仅可结合1分子PABPC，说明仅1分子PABPC就足以有效促进翻译进程。其次，与早期认识不同，稳定状态的poly(A)尾长度与mRNA半衰期相关性不大甚至是负相关的，PABPC的结合并不与稳定期poly(A)尾长度相关联。然而，研究发现mRNA半衰期确实与脱腺苷速率相关。第三，翻译效率与脱腺苷化有强相关性，这支持翻译速率与mRNA稳定性直接关联的观点。最后，poly(A)尾长度以30nt为基数递增说明PABPC在poly(A)上并非随机结合的。相反，第一个PABPC结合在3’UTR和poly(A)尾的连接处，后续的PABPC依次向下游结合，而未被PABPC结合的A很可能被快速降解掉。体外重建的脱腺苷化实验可证明此模型：1分子Pab1分子结合在3’UTR与poly(A)的连接处，而在脱腺苷化进行时Ccr4-Not每次脱除1分子的Pab1。Pab1上最靠近转录本骨架的RRM4可能会结合在3’UTR上，尤其当poly(A)的长度不足容纳RRM4的结合时。与此相吻合的是，RRM4是高度保守的，但并不特异性结合poly(A)。尽管CCR4-NOT的功能在于去除poly(A)尾端的部分且通常认为其降解速率高于PAN2-PAN3，但并非对所有的短poly(A)功能上等效，因为活跃翻译状态的转录本对脱腺苷化的抗性更高。作者推测CCR4-NOT介导的快速脱腺苷化可能仅当其通过一个RNA接头蛋白栓结于某条转录本时才发生。

小结一下，poly(A)尾的长度不仅以转录本特异的方式调节，其代谢还控制着基因表达，以一种更加复杂的、很大程度上依赖于翻译的方式进行。其余诸如mRNA位置等因素是否参与决定poly(A)尾功能仍有待研究确认。

（2）poly(A)尾的影响是由PABPC介导的

尽管在翻译和mRNA降解中随处可见，但PABPC的作用很大程度上仍然是未知的：PABPC如何激活翻译？是否所有mRNA均形成闭环结构？如果答案是否定的，mRNA的5’和3’端如何协调？一条poly(A)尾上平均结合几分子PABPC及这些PABPC在poly(A)尾上如何排布？PABPC结合不同的RNA分子是否存在差异？在脱腺苷化中PABPC的化学计量数起何种作用？

对PABPC在poly(A)尾上结合的分子细节的全面认识有助于完整理解其功能。近期发表的Pan2-Pan3结合Pab1-poly(A)RNP的结构，及早先发表的Pab1RRM1与RRM2的结构给出Pab1在poly(A)RNA上结合的整体组织方式。但由于结构的分辨率有限，Pab1上氨基酸结合RNA及邻近Pab1的精确分子细节尚不清楚。认识上述信息对于设计阻断实验及评估Pab1寡聚化在基因表达中的作用十分重要。

解释PABPC如何调控mRNA代谢的闭环模型是迷人的并已被写入多本教科书堪称经典。然而，其中描述的PABPC与eIF4G的互作似乎不能涵盖PABPC在调控mRNA脱帽和翻译中的作用。在酵母中，Pab1的缺失会导致不完全的脱帽此时mRNA仍带有较长的poly(A)尾；而当eIF4G的功能受损时，无论使用野生型Pab1还是将Pab1与mRNA栓连起来，都未观察到类似的表型，说明脱腺苷化仍是mRNA脱帽的必要前提。所以，Pab1是发生依赖于脱腺苷化的脱帽过程所必需的。不论以顺式或反式阻断翻译起始也并未影响脱腺苷化与脱帽间的关联性。在哺乳动物细胞中敲除PABPC会影响mRNA的稳定性，该表型可通过额外给予无法结合eIF4G的PABPC突变体获得回补。因此，简单地阻断PABPC-eIF4G的互作并未使PABPC失去稳定mRNA的能力。

可能简单的PABPC-eIF4G互作模型并不能完整反映mRNA上真实发生的场景。一项研究中观察到mRNA上至少存在两种闭环状态：经典的闭环是由PABPC和eIF4G（及其他起始因子）介导的，另一闭环是由PABPC与80S核糖体及翻译终止因子eRF3、eRF1的互作所介导的。另外，PABPC在翻译终止中也发挥重要作用，可促进对正常和异常终止事件的甄别。因此，mRNA5’和3’端的联系可能不单单是通过PABPC-eIF4G介导的闭环模式，可能包括核糖体在内的其它因子也参与其中。翻译中的RNP结构是复杂的，PABPC保护mRNA免于降解和促进翻译的真正作用目前仍未可知。为获得闭环模型重要性和普遍性的更多细节，需要知晓翻译和mRNA的稳定性是如何被调节的，可借助引入破坏闭环的形成而非阻断PABPC或eIF4G结合的相关突变，最好是在胞内环境中进行上述实验。

近期研究显示胞内PABPC的浓度可能也对介导poly(A)尾调节翻译和稳定性起重要作用。在早期卵母细胞中，PABPC的浓度是有限的，这使得较长poly(A)尾更易竞争结合PABPC，故含有较长poly(A)尾的转录本更易表达；而在许多体细胞中，PABPC浓度不受限制，故可推测其中大多数poly(A)RNA都会被PABPC结合。与卵母细胞中不同，许多体细胞中已脱腺苷的mRNA是不稳定的，PABPC并不能剧烈影响翻译效率。上述结果可解释为何不同细胞类型中poly(A)尾长度的影响也不相同，即为何poly(A)尾与翻译效率的关系仅存在于特定细胞类型中。

与此发现相吻合，已知胞内PABPC水平是被严格调控的。PABPC自身mRNA的5’UTR含有一段富含A的序列，可结合PABPC蛋白以阻止核糖体的结合从而抑制自身的翻译。因此，一种自调控反馈决定了胞内PABPC与poly(A)尾的比例，该机制对判断poly(A)尾长度如何介导转录后调控可能十分重要。后续还需确认PABPC水平是如何调控的。

PABPC对脱腺苷化的影响亦未明确。CCR4酶可将PABPC从RNA上解离下来，但CAF1不能，这种差异是受调控的吗？PABPC化学计量数对CCR4-NOT活性有何作用，这种作用是否会对mRNA的稳定性产生影响？PABPC对poly(A)尾的亲和力极高，因而可以设想存在一种将PABPC从RNA上去除及调整其在转录组上分布的活化机制。如果PABPC横跨在3’UTR和poly(A)尾之间，某些3’UTR可能更适于结合PABPC，尤其当后者浓度有限时。还有一些证据显示翻译的活化会影响PABPC结合的稳定性。对上述过程的阐述意义重大。

（3）脱帽与脱腺苷化的关联

RNA的成熟过程（包含前体mRNA的剪接、核糖体成熟、microRNA的生成等）是以一系列的RNP转位为特征的，一种复合体的成熟为下一个复合体的形成奠定基础。例如，在mRNA剪接中，RNP转位的顺序确保了内含子的精确去除和外显子的连接。但对mRNA脱腺苷化、脱帽和mRNA降解过程而言，其中涉及的超过30种多肽是如何彼此及与mRNA互作的细节仍然知之甚少。可以确定的是，高等级RNP的组装至少部分确保了脱腺苷化和脱帽的速率。此外，有序的复合体组装同时确保脱帽过程不会先于脱腺苷化发生。

脱腺苷化与脱帽之间似乎通过核糖体直接关联。首先，脱腺苷酶组分Not1、Not2、Not4和Not5均为mRNA脱帽所必需的。其次，脱帽解旋酶Dhh1（在人中为DDX6）也会通过Not1与Ccr4-Not发生作用。第三，Dhh1和脱腺苷酶蛋白Not4和Not5均直接结合核糖体。最后，Not5结合核糖体是Dhh1结合核糖体的前提，这为脱腺苷化直接影响脱帽复合体提供了首个证据。有趣的是，Not5仅在核糖体A、E位点空缺时结合其上，这可能是CCR4-NOT如何感知翻译延伸速率的答案。

几乎可以这样设想，脱腺苷酶和脱帽蛋白不但均可结合于不同状态的核糖体上，而且稳定了该状态，因而促进下游因子的组装并确保其结合的mRNA被降解。Dhh1结合核糖体依赖于Not5与核糖体的互作，该观察很可能为上述假设提供例证。作者预计，理解脱帽和脱腺苷复合体与翻译中的核糖体的互作界面和细节是解开mRNA3’末端如何调控5’端这一谜题的关键。

结论和展望

发现mRNA3’端带有poly(A)已有50多年历史，期间的研究已证实poly(A)尾应为调节mRNA翻译和稳定性的核心因子。感谢技术的巨大进步，曾被奉为经典的模型正受到新实验技术、结构分子和生化重建实验的挑战：poly(A)尾长度与翻译效率之间的关系正在重新被定义，理想的“闭环”模型正面临挑战，对脱腺苷化功能认识的提升也为完整理解poly(A)尾生物学提供新的视角。

作者认为，未来几年将见证mRNA转录后调控研究的复兴，尤其是poly(A)尾介导的调控机制。为此，作者认为应着重解决如下几方面的问题：

1、阐述脱腺苷化速率的调控机制；

2、理解RNP相关（即RNA的序列和结构、密码子上下文、RNA修饰等）如何调节脱腺苷酶活性；

3、理解不同种脱腺苷酶的特异性和作用；

4、获得翻译中mRNP更清晰的结构并认识翻译激活和mRNA稳定中的关键事件；

5、理解不同种PABPC异构型的作用并确认是否参与贡献调节的灵活性；

6、进一步认识PABPC在介导5’端功能和命运中的作用；

7、重新审视poly(A)尾长度如何控制mRNA代谢，尤其需要确认poly(A)的代谢如何在特定生命过程和细胞类型中行使功能；

8、必须认清脱腺苷酶及其不同组分如何与核糖体互作。

随着基于mRNA的治疗手段和疫苗的兴起无疑将激发该领域的研究热潮，因为对基础生物功能认识的提高将有助于提升人类健康水平。理解一条mRNA在细胞质中的命运是其应用及合理改造为治疗手段的前提。由此观之，poly(A)尾的故事还远未结束。

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